缘何碎片质更高
反常里面藏玄妙

质谱是一门试验科学,而试验科学的精髓就是尊重试验的结果,这一点是我们搞试验人员必须时刻要牢记的。“试验”不是“实验”,你要不断的去尝试,尤其是别人没有尝试过的东西(包括动手的尝试和动脑的尝试),而不是总重复别人,如给本科生上实验课一样。如何才能体现对试验的尊重呢?!千万不要用自己已知的经验去限定未知的试验现象,这可能也是专家(这里特指那些只会吹嘘,没有实践经验的人,不要对号入座。)的思想一般都比较顽固的缘故吧。专家的头脑中有过多的思维定式,遇到问题多是从自己以往的经验去判断,如果不符合自己的经验,就会下结论“你做的试验有问题,重做!”。从科学发展的角度看,所有的理论都是建立在对现象的观测的基础上的,随着科学的进步,以往的理论很可能会被推翻或着发展,所以尊重“试验结果”才是更科学的研究科学的方式(理论先行也非常重要,但对我们大多数人来说,还是需要试验为基础)。

每年钟老师实验室会承接大量的临床前研究和生物等效性研究的项目,貌似每年要做50多个。因此,实验室的研究生可以在很短的时间内,接触了大量的研究实例,对于研究生开拓视野和综合能力的培养非常有帮助。每周的组会就是师兄、师姐们大展身手的机会。钟老师那敏锐的思维、犀利的提问,让每个汇报人“痛并快乐着”,“痛”是因为被抓住了自己工作的漏洞,“快乐”是因为每次汇报就是一次提高的机会。除了钟老师的提问,陈老师的发问也经常让人不寒而栗;此外,其他研究生更不会放过机会来展示自己的观点,我记得韩师姐、曾师姐和谢师兄的问题总是很独到,尤其是讲话的腔调,让我记忆犹新。我很享受那几年组会的经历,正是在组会上,我培养了对研究的兴趣。多年以后,我在现在的研究团队中,又发现了那种久违的讨论氛围,在我想彻底放弃研究生涯的时候,又多了一丝希望。

为何开头我强调“试验观测”的重要性呢?我想给大家分享一下我做过的一个研究实例。艾瑞昔布是恒瑞医药开发的一个COX-2选择性抑制剂,相当于辉瑞的重磅炸弹药物(销售额23.8亿美金)塞来昔布的me too药物,现已国内上市。我主要负责其临床前研究,鉴定其在大鼠体内的代谢产物,详细研究工作见我的硕士论文(《艾瑞昔布在大鼠体内的代谢与排泄研究》)。当时采用的技术主要是“碰撞诱导解离(collision-induced dissociation technique,CID)”质谱,即用惰性气体在近真空的状态,与离子化的分子发生碰撞,从而生成分子的系列碎片,而这些碎片是与其结构相关连的,通过分析这些碎片就可推测代谢发生的位点,简单说就是这么一个过程。一般说我们只关心比分子离子峰小的离子,当然在大于分子离子峰的区域确实会有些其他离子,多被认为是仪器噪音而不理会。因为从我们的常识出发,一个砖头,被外力碰撞以后,只能变成碎了的砖头,而不可能变成块头更大的砖头!但在我研究艾瑞昔布代谢物的时候,发现M2在其二级质谱图中,生成了比准分子离子m/z 400多14Da离子,且相对丰度高达60%,这样明显的离子很难被当作背景吧,如下:

MS2 of 艾瑞昔布羧基代谢物

MS2 of 艾瑞昔布羧基代谢物

进一步对碎片离子m/z 382进行MS3分析,仍然生成了m/z 414,真是非常奇怪。

M3 of 艾瑞昔布羧基代谢物

M3 of 艾瑞昔布羧基代谢物

遇到这种现象后,我多次重复,确认不是试验操作的问题,既然确实存在这种显现,那么这类特殊的离子是否会受实验条件的影响呢?也许找到实验条件与这类离子的关系,即可对其进行解析。这里我使用了一个很重要的研究策略,不去纠结为什么会有这种现象,先不管它什么原因,不要让自己被以前的知识限定;也不去到处问所谓的专家,那样自己多半会更迷茫。我能改变的试验条件就是不同的流动相,分别用甲醇、乙醇、乙腈和丙酮溶解样品,进行流动注射分析,结果见下表:

QQ20140118-4

溶剂对m/z 414离子的影响

做完上面的试验以后,只要具有简单的质谱理论知识,加上基本的逻辑就可以得出可能的结论:m/z 414与流动相中的甲醇有关。换成乙醇m/z 414的质量也增加14,这是阳性相关;乙腈和丙酮是阴性相关。在得出这个结论以后,把这种试验现象进行抽象就会得到类似理论的东西或者说是经验规则(我们所从事的研究多是这种发现)。从而我们对发生在离子阱质谱内的这一步反应用下面的图示说明:

M2在离子阱内与甲醇反应的机理

M2在离子阱内与甲醇反应的机理

当我们得出了离子阱的这种“单分子-离子反应”与结构中的羧基有关,自然而然我们会想到,是否其他含有羧基的化合物也有这样的现象呢,如果存在的话,会使我们的推论更加有说服力。因此,我又拿实验室已有的含有羧基的化合物进行了分析,结果如下:

其他含有羧基化合物在离子阱内与甲醇反应的结果

其他含有羧基化合物在离子阱内与甲醇反应的结果

以上试验结果的解释看我的硕士论文吧,不再赘述。从这个实例中,我遵循了研究的最基本过程,发现现象–>寻找与现象相关的因素–>解释现象–>推出经验规则–>应用规则。最后,我要顺便感谢钟老师对我画结构式的指点,包括元素字体的选择、线条的粗细、键角的大小等,从这些细节中让我感受到了钟老师治学的严谨。(待续)