质谱(Mass Spectrometry, MS)与药学研究 (8)

跨界混搭新名词 学科交叉老话题 跨界(crossover)和混搭(mix and match)是当前比较流行的新名词,尤其在其进入互联网以后,被一些大V、名嘴给吹的妇孺皆知,像我等躲在角落搞研究的人,也不能豁免。罗胖子罗歪嘴整天在微信上宣扬下一代的商业模式,其核心就是通过跨界来寻找新的商机,他疯狂的把房子都卖了,以显示其对新的互联网模式的支持。每个人自有其精彩的生活方式,这不是我们关注的重点,只是其提到的跨界概念,在我们药学领域也广泛存在,今天我们就来谈谈药学领域的跨界问题。不过,在药学领域,这个不叫跨界,也不叫混搭,一般称为“学科交叉(inter-discipline)”,可以是用一个学科的技术解决另一个学科的问题,也可以是一个学科的思想启发另一个学科。本质来讲,药学就是学科交叉而来的,比如药物学与化学、物理、计算机等学科的交叉,产生了药物化学、药物分析学、药剂学、药物动力学,药物计量学等,目前,一些新出现的研究领域,更是学科交叉的典范,比如各种组学、网络药理学、计算毒理等。 我对研究的看法是专注一个领域,但不局限于一个领域的技术和思路,“他山之石可以攻玉”,对于其他学科的好东西,“拿来主义”是个不错的做法。我从2001年开始接触质谱,一开始是用来研究药物的代谢产物,到了2005年,开始用来研究中药化学成分的鉴定,一口气在RCM和JMS上发了多篇成分鉴定的文章。后来发现,这类工作基本就是个体力活,难道科研就是这样吗?能否有点不一样的东西呢?随着仪器的进步,从药材或中成药的提取物到LC-MS数据采集,这个过程越来越程序化和自动化,而对采集以后的数据分析却是最耗时和难以自动化的过程!我本身有点编程的基础,其实就一点点,仅是本科时用来追女生的那点玩意儿。那时就想,是否可以用计算机技术来提高LC-MS数据分析的效率呢?可否让程序来模拟人分析数据的过程呢?至少有某些步骤是可以通过计算机来提高效率的,于是我在不同方面做了一些粗浅的尝试,也写了一些小工具: 1. 【加合离子计算器】adduct ions cal: 功能:判断全扫描质谱图中所有可能加合离子的类型; 参数文件中提供了常见MS中加合离子的类型,可自己增加; 使用方法:在Finnigan工作站中,选中化合物的质谱图,右键“Export-->Clipboard (Exact Mass)”,把质谱数据拷贝到剪切板,然后点程序右下角的“Paste MS”;选一个可能的准分子离子(默认是最高的),点“Go”运行,匹配的加合离子及其类型显示在中间文本框中。 双击程序中间的空白区域有惊喜! 这个程序的年份有点老了,有很多不足的地方:(1) 不能自动判断哪个是准分子离子,需要人工指定,然后看看哪种情况可计算得到的加合离子与实际质谱图最匹配(上图中那个11 results,指找到11个匹配的离子);(2)仅支持Thermo Finnigan的工作站。 2. 【质谱数据整理工具】Mass 2 Table 2.1 多级质谱数据整理利器,MS文章发表必备神器! 功能:自动将Finnigan获得多级质谱数据转化成文章发表需要的格式:质荷比(丰度);同时输出绝对强度和相对强度;可调整输出的小数点位数和截止的最小丰度 使用方法:在Finnigan工作站中,选中化合物的多级质谱图,右键“Export-->Clipboard (Exact…

质谱(Mass Spectrometry, MS)与药学研究 (7)

一锅中药惹人愁 寻得关键才无忧 前文讲到由于质谱自身关于化合物精细结构的信息有限,需借助已有标准物质建立裂解规律,才能对同类物质的未知结构进行推断。除了借助标准品的信息,中药中成分间自有的关联信息也非常有用。中药(包括药材和方剂),甚至植物药,中的成分间往往存在某种特定的关系,很少遇到仅是孤零零几个不相关成分的情况,这个特点特别适合于用质谱分析,并且鉴定的时候,不出结果则已,一出结果那就是一大串化合物同时被鉴定了。因此,找到这个一锅粥中的内在联系,将会使我们的质谱分析工作事半功倍。 那这些化合物中到底又怎样的内在联系呢?很简单,看懂上面一张图就行了!别紧张,这张图确实比质谱图复杂多了。首先简单说下,上面的图代表什么!它是目前对植物体内次生代谢产物(secondary metabolites)的生物合成途径(biosynthesis pathway)的总结,每种颜色代表一大类天然产物,每个实心圆节点代表一个关键的生合成反应,不同的反应通过实线链接,这样就把诸如黄酮、生物碱、萜、甾体等天然产物间的关系表述清楚了。但知道这些东西对我们质谱解析有用吗?或者说该怎么用呢?Show这张图的目的,是想先给大家一个整体的印象,了解一下,原来我们中药这锅粥里面竟然有这么玄妙的关系,在以后想进一步了解相关知识的时候,知道该去哪里查找资料,知道这叫“Biosynthesis”!OK! Now, you are in a new world! 若是具体到我们分析的某一味药材,可能涉及的仅是上图中的一个或几个生合成途径而已,实际操作的时候简单的多。记得,那是在我读研的时候,第一次听吴立军老师讲天然产物的生物合成,他那抑扬顿挫、略带磁性的声音,让我忘记了偷看课桌前面的美女。那时貌似只有一本发黄的、小32开的薄书,加上网络还不发达,可以获取的信息非常有限,不过,重要的是,吴老师在我头脑中种下了“生合成”的种子,否则,当我在博士阶段研究质谱的时候,根本不可能把生合成与质谱解析联系起来。在此,对吴老师献上我深深的敬意。 读博士时研究的第一个植物中含有大量异喹啉生物碱,这类生物碱在质谱上的响应非常好,但是色谱的峰形不好,当分析药材时,主要成分的峰都很宽,这导致可鉴定的成分就那么几个,总是感觉有点欠缺。有天画结构的时候,突然发现这些结构中貌似有什么关联,见下图: 上图中左上角的化合物为苄基异喹啉最简单的一个化合物去甲乌药碱,其右边的两个结构与其是等价的,通过不同位点的环合就可以得到原小檗碱型、啊朴啡型和左吗喃型三大类最常见的异喹啉生物碱。突然记起以前上的生合成课,推测它们一定遵循相同或相似的生合成途径。根据生合成的信息,至少可以给我们两方面的提示: 既然有终产物(原小檗碱型生物碱等),那么应该也有一些中间产物(没有成环的苄基异喹啉,或没有苄基的简单异喹啉成分),通过在LC-MS数据中提取这些可能存在的生物碱的质量数,我们后来发现了多个苄基异喹啉和简单异喹啉化合物; 生合成是酶催化的反应,所以反应位点就是可以从已报道的化合物中总结出来的,那样我们就可以推测位置化合物的结构。比如一个未知化合物比已知的成分多了16Da,裂解途径也相似,那么就可以根据生合成的规律推测羟基所在的位点。 化合物6就是我们发现的一个苄基异喹啉的衍生物,它的裂解特征与去甲乌药碱类似,只是质量数更大,推测为去甲乌药碱进一步修饰得到的,从下图中的可清楚的看到化合物6是如何推测得来的,其遵循的原则就是其可代谢位点仅发生在上图去甲乌药碱红色标记的地方。 上图中绿色的结构为最终推测的结果,但要确认是否真的是这个结构,仍要对其质谱图中的碎片进行详细归属,只有在主要的碎片都可以解释的情况下,才可认定这个推测的结构可能正确。根据上篇文章所讲的一三断裂规律,我们对碎片的归属如下: 更多的结果请参考我们发表在Rapid Communication in Mass Spectrometry上的论文,该论文已被引用40次。 Characterization of isoquinoline alkaloids, diterpenoids…

质谱(Mass Spectrometry, MS)与药学研究 (6)

多少解谱心酸事 都付一三笑谈中 这个坑挖的太久了,好久没填了,真是不好意思!那今天就来点ESI质谱解析中最关键的猛料,可以这么说吧,只要掌握这一点,就掌握了质谱解析的百分之八十以上,其他的就靠自己回去偷着演练了。今天的内容相当于武功里面的“九阴真经”和“葵花宝典”!不过不需要自宫哦~ 首先我们要明白为什么质谱,尤其是多级质谱的解析很难,甚至比核磁还难?!这是因为其提供的信息非常有限,NMR可以提供原子层次的信息,而质谱只能提供到基团(多个原子构成的特定组成)层次。这些有限的信息,少到从理论上就不可能推测出一个唯一的结构!是啊,确实如此,就像我们遇到了无解的方程,难道还有比这更难的吗?举了例子,对绝大多少小分子化合物来说,一套NMR图谱(1H, 13C, HMQC, HMBC),有经验的人就可以推测出其结构;而拿来一套小分子的多级质谱,即便有10级的数据,如果解析的人不知道其他背景知识的话,比如样品是天然产物,还是合成的,若是天然产物,来自什么植物或药材,有没有紫外吸收等等,绝大多数情况没有人可以确切的推出化合物的结构。当然,你们可能会问我,给我一套多级质谱数据,我是否能推出其结构呢?这个问题留待后面回答! 看到这里,是不是感觉很失望!既然这么难,为什么非要用质谱分析呢?用NMR不就得啦!不然,质谱的优势在于其灵敏度高,同时在其与LC联用以后,就成为一种强大的混合物分子工具(LC-MS),这是NMR不可比拟的。LC-MS成熟以前,若要研究清楚一味药材中有哪些成份,不花几年功夫,基本没戏,一般一个植化的硕士或博士研究清楚一个药材就可以毕业了!但有了LC-MS,这个过程可能只需要几个月,甚至几周就可以获得以前需要几年才能获得的信息!因此,质谱是其他技术暂时无法替代的! 虽然普遍意义上的质谱数据没有唯一解,但只要限定研究的范围和条件,那还是有解可循的。就如化合物的浓度与其UV响应的关系我们是没法知道的,可在一个很窄的范围内,就能用直线来近似他们的关系!那么如何限定质谱研究的范围呢?首先我有几项假设,所有的质谱推理都建立在它们之上: 假设1:结构相似的化合物具有相同或相似的裂解规律; 假设2:化合物的裂解行为的外因是质谱构造和碰撞能量,内因是分子结构特性,外因决定几率,内因决定终点; 假设1首先肯定了在某些情况下,即结构相似,质谱的裂解数据是有规律可循的!结构相似,可以指有相同的官能团,或者在天然产物分类上属于一类,比如都属于黄酮、甾体、萜等。这个相似性越接近,那么它们具有相同的裂解形式的可能越大,同属于查尔酮的化合物间的行为就比其他黄酮更接近。 假设2更进一指明了化合物的结构与质谱的关系,主要用来解决“为什么不同质谱仪器获得的质谱数据有很大差别”(NMR不应该有这种情况)的问题,可以肯定一点,不同仪器获得的数据是有规律可循的,这一点也为我们建立不同质谱仪器数据的智能解析程序鉴定了基础(我们正在开发的一种秘密武器)!“外因决定几率”指碎片离子在质谱图上的丰度高低,“内因决定终点”是指可能存在哪些类型的碎片离子。 有了以上两点假设,就可以明白为什么现在的研究论文都是“***类化合物的多级质谱研究”或“质谱法研究**中的***类化合物”了!不这样做,事情就没得玩儿!通过前面两个假设,知道了质谱的规律性在一个很小的范围内是可以成立的,那最关键的就是建立这一小类化合物的裂解规律,而如何建立裂解规律呢?要先从分析已知化合物的多级质谱入手。那么、可是我们还不知道它们的裂解规律啊,怎么分析这些质谱数据呢?我想这就是大多数人遇到的第一个难题了,获得了质谱数据,即便是已知化合物的,也不知道那些棒棒们代表什么!在这里,我假定大家已经知道了最基本的质谱知识,比如full scan, MS/MS, 准分子离子,碎片离子,丰度等。直接进入我们今天题目中所讲的、传说中的、最神秘的“一三断裂”,可以说“一三断裂”是CID(碰撞诱导解析)质谱中最常见的裂解形式,与以往70eV的EI-MS非常不相同。EI-MS中的能量太高了,一般小分子的大部分结构单元都受不起这么高的能量,碎的面目全非;而ESI-MS中的CID温和很多,并且碰撞的能量还不是一气就全招呼上,慢慢来,一点一点的把化合物结构中不稳定的部位给敲掉。正是因为能量不高,化合物结构中不同基团的特异性差异才得以最大化的体现,也让分子有机会摆好“一三”的pose后,才被打掉!说的专业一点,“一三断裂”是一种能垒较低的裂解反应!大家熟知的麥式重排仅是“一三断裂”的一个特列而已,据我所知,现有的小分子内的重排裂解都可归到“一三断裂”中(参看我2007年写的“奇怪的远距离重排”)! “一三断裂”的具体内容在我的硕士论文的第35页,下面是抓图:   你们是不是觉得这个太简单了,好似大家都知道吧!唉,这么多年了,我就靠这么点本事混饭吃啊~以后谁再说质谱解析难,看看上面的图然后回家面壁吧!感兴趣的可以用这个规律去解释我2007年那篇重排文章的例子。当然会有一些例外,比如自由基断裂,还有黄酮中4-CO的丢失等。如果你实验中,遇到一些不符合这个规律的例子,欢迎与我分享。(待续)

[藏书千卷不如读书一卷]基于酶和转运体的DDI研究(4)

Chapter 3 ADME Pharmacogenetics and Its Impact on Drug–Drug Interactions Abstract CYP酶CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, and CYP2D6和转运体 ABCB1 and OAT1B1具有genetic polymorphisms, 约占人群的1% 3.1 Introduction pharmacogenetics的关注重点已由最开始的药物代谢酶(M),扩展到影响ADE的膜转运体 Genetic variants not only determine to which extent a…

[藏书千卷不如读书一卷]基于酶和转运体的DDI研究(3)

Chapter 2 Transporters: Importance in Drug Absorption, Distribution, and Removal Introduction:transporters的分类 SLC (solute carriers, 溶质运载蛋白家族) and ABC (ATP-binding cassette,  ATP结合盒转运载体)  SLC有380多个成员,48个subfamilies,其中约19个gene families的转运活性已被研究,如SLCO, SLC15, SLC22, SLC47 已被鉴定的ABC转运体有7个subfamilies,49个蛋白,一些对药物有特异性,如ABCB, ABCB,and ABCG subfamilies. Tables 2.1和2.2总结了对药物的处置、PK差异、DDI有巨大影响的转运体。…

能否通过单纯IV或IG计算药物体内代谢的比率呢?

问题:假定药物在体内是一室分布,通过IV或IG给药,同时测定parent和metabolite随时间变化的浓度(摩尔浓度),能否根据这些数据计算出药物代谢的比例,即有多少百分比的药物生成了代谢产物! 有人建议通过计算代谢物与原型药物峰面积的比值,来估算生成代谢物的比率。Metabolism Rate (MR%) = 100*AUC_m/(AUC_m+AUC_p) 这种方法基于线性PK的一种外推,因为线性PK的剂量与AUC是成正比的,所以代谢物AUC与代谢物和原型AUC和的比值就是MR%. 这种估算方法是否正确呢?!我们下面进行一下推导,先是考虑IV的情况,假定药物生成代谢物的速率恒定,只与浓度有关,这种假设代谢酶远远没有饱和的情况下是合适的。推导过程借助matlab的符号工具箱完成: %根据微分方程组求解原型A和代谢物B与时间的关系 % A,B为药物的摩尔浓度,V1和V2为原形和代谢物的分布容积,Km代谢物生成速率,Ka和Kb为原形和代谢物的消除速率 % C为原形累积量,D为代谢物累积量 >> syms A B C D Ka Kb Km V1 V2 >> Y=dsolve('DA=-Ka*A-Km*A','DB=Km*A*V1/V2-Kb*B','A(0)=100','B(0)=0') % 化简 >> A=simplify(Y.A)…

[藏书千卷不如读书一卷]基于酶和转运体的DDI研究(2)

Chapter 1: Enzymatic Basis of Phase I and Phase II Drug Metabolism 本章综述一相和二相解毒酶,它们潜在的诱导和抑制功能,以及基因改变在DDI中的角色。 人体内的酶种类繁多,普遍存在polymorphisms;基因水平的改变会影响药物的处置和DDI,这通常被成为idiosyncratic drug reactions (特异性药物反应)。 代谢酶分为Phase I和Phase II,Phase I主要为CYP酶系,除了肝脏外,其他肠道等器官的分布也很重要; Phase II有UGTs, SULTs, GSTs and NATs. FDA批准的药物有60%是CYP酶系代谢的 Fig.1.1 为CYP450的通用代谢过程图。…

[藏书千卷不如读书一卷]基于酶和转运体的DDI研究(1)

去年(2013年)我在空余时间读完了14本书,其中5本为英文原著,不过多是一些科普、宗教和小说类的书籍,今年想把自己计划阅读的书单偏重于专业书。专业书多为七八百页,甚至上千页的大部头,给自己的要求是,不仅要看,还要做好每章内容的摘要和笔记。我相信一个看法,只有用自己的话,把书中的内容写出来,才算学到了东西。第一本书,我选择的是“Enzyme- and Transporter-Based Drug–Drug Interactions”,书相当于一系列主题的综述,多是事实性的内容,有助于增加自己在DDI方面的知识面和系统性。我争取每周读一章,并摘录要点。   该书的主编Sandy Pang前段时间来找我现在的老板,好似谈组织什么会议的事情。她是一个非常严谨的老太,有企业界的人问她有没有毕业生推荐,她回答说“We don't graduate students easily!”我的师兄曾去她那里受苦过一年,被逼得都不行了,呵呵。不过,在学术方面,Sandy Pang确实是一个优秀的科学家。 这本书共有4个部分,28章,700多页,即便每周一章,也需要半年时间。暂时不给自己太多压力,2014年只要读完2本专著就算完成任务啦。   About the Author K. Sandy Pang Ph.D. is Professor of Pharmacy and Pharmacology, Faculties of…

质谱(Mass Spectrometry, MS)与药学研究 (5)

缘何碎片质更高 反常里面藏玄妙 质谱是一门试验科学,而试验科学的精髓就是尊重试验的结果,这一点是我们搞试验人员必须时刻要牢记的。“试验”不是“实验”,你要不断的去尝试,尤其是别人没有尝试过的东西(包括动手的尝试和动脑的尝试),而不是总重复别人,如给本科生上实验课一样。如何才能体现对试验的尊重呢?!千万不要用自己已知的经验去限定未知的试验现象,这可能也是专家(这里特指那些只会吹嘘,没有实践经验的人,不要对号入座。)的思想一般都比较顽固的缘故吧。专家的头脑中有过多的思维定式,遇到问题多是从自己以往的经验去判断,如果不符合自己的经验,就会下结论“你做的试验有问题,重做!”。从科学发展的角度看,所有的理论都是建立在对现象的观测的基础上的,随着科学的进步,以往的理论很可能会被推翻或着发展,所以尊重“试验结果”才是更科学的研究科学的方式(理论先行也非常重要,但对我们大多数人来说,还是需要试验为基础)。 每年钟老师实验室会承接大量的临床前研究和生物等效性研究的项目,貌似每年要做50多个。因此,实验室的研究生可以在很短的时间内,接触了大量的研究实例,对于研究生开拓视野和综合能力的培养非常有帮助。每周的组会就是师兄、师姐们大展身手的机会。钟老师那敏锐的思维、犀利的提问,让每个汇报人“痛并快乐着”,“痛”是因为被抓住了自己工作的漏洞,“快乐”是因为每次汇报就是一次提高的机会。除了钟老师的提问,陈老师的发问也经常让人不寒而栗;此外,其他研究生更不会放过机会来展示自己的观点,我记得韩师姐、曾师姐和谢师兄的问题总是很独到,尤其是讲话的腔调,让我记忆犹新。我很享受那几年组会的经历,正是在组会上,我培养了对研究的兴趣。多年以后,我在现在的研究团队中,又发现了那种久违的讨论氛围,在我想彻底放弃研究生涯的时候,又多了一丝希望。 为何开头我强调“试验观测”的重要性呢?我想给大家分享一下我做过的一个研究实例。艾瑞昔布是恒瑞医药开发的一个COX-2选择性抑制剂,相当于辉瑞的重磅炸弹药物(销售额23.8亿美金)塞来昔布的me too药物,现已国内上市。我主要负责其临床前研究,鉴定其在大鼠体内的代谢产物,详细研究工作见我的硕士论文(《艾瑞昔布在大鼠体内的代谢与排泄研究》)。当时采用的技术主要是“碰撞诱导解离(collision-induced dissociation technique,CID)”质谱,即用惰性气体在近真空的状态,与离子化的分子发生碰撞,从而生成分子的系列碎片,而这些碎片是与其结构相关连的,通过分析这些碎片就可推测代谢发生的位点,简单说就是这么一个过程。一般说我们只关心比分子离子峰小的离子,当然在大于分子离子峰的区域确实会有些其他离子,多被认为是仪器噪音而不理会。因为从我们的常识出发,一个砖头,被外力碰撞以后,只能变成碎了的砖头,而不可能变成块头更大的砖头!但在我研究艾瑞昔布代谢物的时候,发现M2在其二级质谱图中,生成了比准分子离子m/z 400多14Da离子,且相对丰度高达60%,这样明显的离子很难被当作背景吧,如下: MS2 of 艾瑞昔布羧基代谢物 进一步对碎片离子m/z 382进行MS3分析,仍然生成了m/z 414,真是非常奇怪。 M3 of 艾瑞昔布羧基代谢物 遇到这种现象后,我多次重复,确认不是试验操作的问题,既然确实存在这种显现,那么这类特殊的离子是否会受实验条件的影响呢?也许找到实验条件与这类离子的关系,即可对其进行解析。这里我使用了一个很重要的研究策略,不去纠结为什么会有这种现象,先不管它什么原因,不要让自己被以前的知识限定;也不去到处问所谓的专家,那样自己多半会更迷茫。我能改变的试验条件就是不同的流动相,分别用甲醇、乙醇、乙腈和丙酮溶解样品,进行流动注射分析,结果见下表: 溶剂对m/z 414离子的影响 做完上面的试验以后,只要具有简单的质谱理论知识,加上基本的逻辑就可以得出可能的结论:m/z 414与流动相中的甲醇有关。换成乙醇m/z 414的质量也增加14,这是阳性相关;乙腈和丙酮是阴性相关。在得出这个结论以后,把这种试验现象进行抽象就会得到类似理论的东西或者说是经验规则(我们所从事的研究多是这种发现)。从而我们对发生在离子阱质谱内的这一步反应用下面的图示说明: M2在离子阱内与甲醇反应的机理 当我们得出了离子阱的这种“单分子-离子反应”与结构中的羧基有关,自然而然我们会想到,是否其他含有羧基的化合物也有这样的现象呢,如果存在的话,会使我们的推论更加有说服力。因此,我又拿实验室已有的含有羧基的化合物进行了分析,结果如下: 其他含有羧基化合物在离子阱内与甲醇反应的结果 以上试验结果的解释看我的硕士论文吧,不再赘述。从这个实例中,我遵循了研究的最基本过程,发现现象-->寻找与现象相关的因素-->解释现象-->推出经验规则-->应用规则。最后,我要顺便感谢钟老师对我画结构式的指点,包括元素字体的选择、线条的粗细、键角的大小等,从这些细节中让我感受到了钟老师治学的严谨。(待续)